top of page
Ez a webhely a
.com
webhely-tervezővel készült. Saját webhely létrehozása még maKezdés most!

Gyakorlat

 

Ezen az oldalon sok hasznos leírást, forrást, módszert, használati útmutatót találhatsz, amelyek elsösorban a gyakorlatoknál lesznek segítségedre.

Anchor 2

Mikropipetta

 

A mikropipetta azon eszközök egyike, amivel az iskolában nem nagyon találkozhattatok, de az IBO-n biztos, hogy fogtok. Az alábbi rövid videóban nagyszerüen megmutatják a mikropipetta helyes használatát. Utána röviden le is írom a pipettázás menetét. Nem biztos, hogy ugyanilyen pipettát fogtok használni, de érdemi különbség nincs a pipetták között.

A pipettázás menete:

  1. ​megfelelö térfogattartományú pipetta kiválasztása

  2. megfelelö térfogattartományú pipettahegy kiválasztása

  3. a kívánt mennyiség beállítása (figyeljetek az értékesjegyekre!)

  4. a pipettahegy felhelyezése (a hegyhez TILOS hozzáérni, erösen nyomjátok bele a pipettát a hegybe, hogy le ne essen!)

  5. nyomógomb benyomása elsö ütközésig

  6. a pipettahegy végének behelyezése az 1. mintába

  7. a nyomógomb ÓVATOS felengedése (ha hirtelen engeditek fel, az 1. minta feltapadhat a hegy belsejére, vagy akár a pipetta belsejébe is juthat)

  8. a pipettahegy végének belehelyezése a 2. mintába/tárolóba, vagy hozzáérintése a tároló falához (a felkeveredés, habosodás elkerülése végett)

  9. a nyomógomb benyomása második ütközésig

  10. a pipetta kivétele a 2. mintából

  11. a pipettahegy kilövése hulladéktárolóba a kilövö gomb megnyomásával

FONTOS!

  • a pipettát lehetöség szerint függölegesen, de semmiképpen se fejjel lefelé tartsátok!

  • nem juthat folyadék a pipetta belselyébe, mert tönkreteszi!

  • föleg nagyobb mennyiségeknél óvatosan engedjétek fel a nyomógombot

  • minden pipettázáshoz külön hegyet használjatok, hacsak nem kaptok más utasítást, vagy nem vagytok biztosak benne, hogy csak egy anyaggal érintkezik a pipetta

  • ha bármilyen módon beszennyezödik a hegy, használjatok másikat!

Anchor 8

Gélelektroforézis

 

Ezzel a technikával szintén könnyen összefuthattok a gyakorlatokon. Az alábbi videón bemutatják a futtatócella használatát (mellesleg pont ilyen típust használnak a válogató döntöjén). Sajnos nem mutatják be viszont a gél kiöntését. Erröl az egyszerü müveletröl könnyen találhattok videót a neten, de amúgy sem valószínü, hogy feladat lesz. A videó alatt le is írom az elökészítés, futtatás, elöhívás és kiértékelés menetét.

A gélelektroforézis menete:

  1. ​a gél elökészítése (kivétele tárolóból, esetleg kiöntése)

  2. a futtatócella feltöltése pufferrel

  3. a gél behelyezése a futtatócellába (a zsebek a negatív pólus felé vannak)

  4. futtatni kívánt minták elökészítése (általában DNS, hasítóenzimek és festék összepipettázása eppendorf csövekben)

  5. a minták betöltése a gélzsebekbe

  6. a futtatócella tetejének felhelyezése

  7. a futtatási idö és feszültség beállítása

  8. a futtatás megkezdése

  9. megadott ideig a gél futtatása

  10. a futtatás leállítása

  11. a fedö levétele

  12. a gél kiemelése

  13. a gél elöhívása (általában ultraibolyafényben lefényképezik)

FONTOS!

  • vigyázzatok a gélre, nehogy eltörjön!

  • jelöljétek meg az eppendorf csöveket, készítsetek tervet arról, hogy melyik zsebbe mi fog kerülni, nehogy késöbb összekeverjétek!

  • figyeljetek oda a futtatási irányra (a DNS mindig a pozitív pólus felé fut)!

  • mivel sok az inkubációs idö, érdemes elöre megtervezni a teendök sorrendjét (amíg fut a gél, tudtok csinálni más feladatot)!

  • az elöhívás általában közös eszközzel történik, minél gyorsabbak vagytok, annál kevesebbet kell majd várni!

A gélelektroforézis elmélete, kiértékelés:

A gyakorlaton szinte biztos, hogy plazmidot fogtok hasítani valamilyen restrikciós endonukleázzal (egy ilyen hasítási térkép látható a jobb fenti képen). A vizsgálni kívánt szakaszokat PCR-ral felszaporítjátok, majd festés után megfuttatjátok a gélen. A gélelektroforézis müködési elve, hogy a DNS szakaszok a pozitív pólus felé vándorolnak az agaróz gélben, viszont mivel a rövidebb szakaszoknak kisebb az ellenállásuk, ezért gyorsabban haladnak. Ez lehetövé teszi a DNS szakaszok méret szerinti (mértékegysége: bp, azaz bázispár) különválasztását. A gélen a vizsgált minták mellett egy ún. létrát is futtatunk, ami ismert hosszúságú DNS szakaszokat tartalmaz, amihez viszonyíthatjuk a többi szakasz hosszát.

 

A jobb alsó képen egy megfuttatott gél látható. Fent látszanak a zsebek, baloldalt a létra, töle jobbra pedig a négy darab minta. A két szélsö minta láthatóan egy DNS szkaszt taralmaz (a jobb szélsö rövidebb, mint a bal szélsö), míg a két középsö azonos módon hasított két-két szakaszt. A létrához képest az összes szakasz elég hosszú.

 

Mivel a hasítóenzimek bázissorrend specifikusak, alkalmasak pontmutációk kimutatására. A feladatokban szerepelni szokott, hogy éppen mit kell vizsgálni, ennek megfelelöen egy plazmidtérképböl ki kell tudni választani a megfelelö restrikciós enzimet, az elöhívott gélböl pedig le kell tudni olvasni a kapott szakaszok hosszát, amiböl következtetést lehet levonni a jelenlévö mutációkra a megadott adatok alapján.

Spektrofotometria

Anchor 3

A spektrofotometriás mérés  menete:

  1. ​a minták elökészitése a küvettákban:

    • bemérendö minta

    • higító közeg

    • megfelelö festék hozzáadása

  2. a minták összekeverése pipettával, vagy a küvetták föl-le fordításával (höfóliát használva)

  3. a küvetták behelyezése a spektrofotométerbe

  4. spektrofotométer beállítása és mérések elvégzése

A spektrofotometriás mérés  elmélete, kiértékelés:

A spektrofotometriát arra szokták használni, hogy egy oldatban található vegyületcsoport (pl. DNS, fehérje), vagy más kolloid (pl. baktériumok) koncentrációját meghatározzák. Ehhez a vizsgált anyagot megfestik, majd megfelelö hullámhosszú fénnyel megvilágítják, és a visszanyert fény intenzitását mérik, amiböl következtetni lehet a minta koncentrációjára. A spektrofotométerek általában az abszorbancia értékeket adják meg, amiböl a Lambert-Beer-törvény segítségével (amit meg fognak adni, ha szükség lesz rá) ki lehet számolni az oldat koncentrációját. Az elméletröl további infó itt.

 

A méréshez szükség van egy standard higítási sorra, aminek abszorbancia-koncentráció görbéje lesz a kalibrációs görbe. Az ismeretlen koncentrációjú minta abszorbanciáját felhasználva a görbére illesztve, vagy lineáris interpolációval megkapjuk a koncentrációt. Fontos, hogy a higítási sor elsö tagja ún. blank, ami a higító közegböl áll, és abszorbancia értéke 0 kell, hogy legyen. Ha nem annyi, akkor az adott értéket az összes mérési eredményböl kivonva kapjuk meg a korrigált értékeket.

FONTOS!

  • a küvettákat mindig csak a durva felszínüknél szabad megérinteni!

  • érdemes megszámozni a küvettákat

  • ha microplate-tel dolgoztok, még jobban ügyeljetek arra, hogy megfelelö helyre mérjetek!

bottom of page